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蛋白酶K

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

蛋白酶K（Proteinase K），相對(duì)分子量約為29.3 kDa, 是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，應(yīng)用廣泛，可用于制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶等實(shí)驗(yàn)，蛋白酶K的一般工作濃度是50—100µg /ml。因蛋白酶K在變性劑如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根據(jù)所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH、溫度等因素確定具體的工作濃度。蛋白酶K在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4-12.5）均有活性。

蛋白酶K有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機(jī)理并無(wú)直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染核酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶k消化過(guò)程中通常也加入EDTA（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對(duì)蛋白酶k具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l，以鰲合Ca2+。

運(yùn)輸和儲(chǔ)存

      冰袋運(yùn)輸，-20 ℃保存，可以保存12個(gè)月。避免反復(fù)凍融。

使用方法

      1. 配制蛋白酶K溶液：一般以20mg/ml濃度配制蛋白酶K溶液。將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml dd水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

      2. 根據(jù)終濃度50—100µg /ml，吸取適量蛋白酶K溶液，到待消化樣品中，孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時(shí)間為15分鐘至48小時(shí);理想孵育時(shí)間為2小時(shí)。推薦反應(yīng)緩沖液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。

注意事項(xiàng)

蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的樣品處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，能增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)，提高雜交信號(hào)。但蛋白酶K的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí)，都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核的消失，從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現(xiàn)的問(wèn)題，并能達(dá)到理想的染色效果。

常用蛋白酶作用位點(diǎn)